Как производят инсулин?

«Мегабайт» побывал на заводе ГЕРОФАРМ — единственном в стране производителе инсулина полного цикла — и узнал, как из одной бактерии кишечной палочки получить партию препарата, который ежедневно спасает миллионы жизней.

Трехостановочный маршрут

Чтобы проследить за всеми этапами производства, нам пришлось бы отправиться в путешествие по нескольким объектам, а на нашем маршрутном листе красовалось бы «Стрельна — Пушкин — Оболенск».

Первая остановка — научно-исследовательский центр, в котором разрабатывают штаммы-продуценты (то есть те, из которых затем будут получать органические вещества), технологию производства субстанций и лекарственных препаратов. Также в Стрельне проводят стандартизацию препаратов, все необходимые исследования, а далее формируют пакет документов для регистрации.

Технология основана на генно-модифицированной бактерии кишечной палочки. При разработке лекарства в бактерию встраивают чужеродную ДНК, в составе которой есть ген, отвечающий за синтез белка проинсулина.

Банк клеток — основа производственного процесса компании. Определенные виды инсулина основаны на разных штаммах-продуцентах, посевная культура каждого из них хранится в пробирках объемом 1 мл в морозильных камерах при температуре -70 °С и ниже. Культуру ежегодно проверяют на продуктивность, жизнеспособность и прочие важные показатели качества.

На завод в Пушкин передают главную посевную культуру, которая хранится в особых условиях, и из нее готовят уже рабочую посевную культуру, которая также хранится в пробирках в сейфах. Производят инсулин в два этапа. Первый — биосинтез, где из 1 мл рабочей культуры должно вырасти множество клеток, внутри которых синтезируется инсулин. Вторая часть — очистка, где из клеток необходимо достать инсулин и освободить его от примесей. Высокоочищенный инсулин в виде порошка передается на предприятие в город Оболенск Московской области, где его превращают в раствор, а далее в готовый лекарственный препарат для пациента.

Из трех остановок наша команда выбрала вторую и отправилась на завод в Пушкин. Чтобы в России инсулина хватало всем нуждающимся пациентам, требуется производить 800–850 кг субстанции в год. Расчетная мощность завода ГЕРОФАРМ — 1 000 кг.

От 1 мл до 3 000 л

Биосинтез начинается на так называемой кухне для бактерий (помещение приготовления питательных сред для роста и размножения культуры), куда нас сопровождает Иван Анатольевич Сергеев, директор завода: «Почти все кабинеты и основные производственные зоны у нас за стеклом, так как одна из ценностей компании — открытость. Заходя в здание завода, люди делятся на три потока. Первый идет налево — это офисные сотрудники, те, кто работают не в производственной зоне. Остальные идут в женскую и мужскую раздевалки, где переодеваются в специальную технологическую одежду».

Конструкция оборудования «кухни» симметрична, имеет вид каскада и напоминает устройство фонтанов в Петергофе. Прежде чем посадить бактерию в ферментер, где она будет расти, размножаться и производить внутри себя инсулин, нужно подготовить для нее сбалансированное питание. Чем оно лучше, тем больше субстанции можно сделать.

Бактерия в реакторах объемом 200 л потребляет растительные пептоны, глюкозу, аминный азот, кислород и прочие микроэлементы, важные для эффективного роста и размножения. Дальше все это подается в сборник, откуда идет подпитка основного ферментера. Из 1 мл клеток менее чем за сутки получается около 3 000 л культуральной жидкости, где клетки сами внутри себя начинают производить инсулин. Сначала готовится подпитка на одну серию, параллельно другое оборудование очищается, начинается подготовка к следующей серии. В результате работа ведется непрерывно.

Клетки-матрешки

На следующем этапе необходимо достать инсулин из клеток. Они устроены по принципу матрешки. Первый слой — стенка бактерий. Внутри нее — тельца включения, а уже в них гибридный белок с инсулином. Нужно разорвать наружный слой, достать инсулин и очистить его.

На первой стадии 3 000 л полученной жидкости прогоняют через сепаратор, извлекая лишнюю воду и концентрируя массу клеток до 600 л. Дальше эти клетки проходят через гомогенизатор, в котором разрушается клеточная стенка бактерий и извлекаются тельца включения. Так как в клетку встроена чужеродная ДНК, клетка производит инсулин, ей не свойственный, и пытается его «выпихнуть», тем самым очень плотно упаковывая его. Чтобы его достать, нужно разрушить клеточную стенку. Для этого давление в гомогенизаторе с 1 атм повышается до 1 000. Клеточная стенка при этом не рушится, она очень эластичная, давление сжимает клетку до очень маленьких размеров. Затем давление резко сбрасывается обратно до 1 атм. Такие перегрузки клеточная стенка не выдерживает и лопается. Все органеллы, ДНК собственной клетки, а также тельца включения попадают в массу — суспензию. С помощью центрифуги упакованные тельца включения отделяются от всего остального.

В итоге биосинтеза получается паста телец включения. Это устойчивый, содержащий инсулин продукт, который хранится в морозильных камерах, а затем используется на стадии очистки. Все, что осталось от клетки, отправляется в килл-танки, где биологический отход дезактивируется. После взятия пробы отходы попадают на очистные сооружения.

Из пасты в порошок

«Основная масса людей, которая работает на производстве, — технологи. Средний возраст персонала — 33 года. Общее количество сотрудников — около 190. Специалистов обучаем на месте, образование — фармацевтическое, биотехнологическое, инженерно-технологическое. Фармацевты и провизоры в основном работают в службе качества, участвуют в разработках; технологи — на производстве».

4 584 575*
численность пациентов с сахарным диабетом в России на 1.01.2019
*эта цифра постоянно растет

В соседнем помещении Иван Анатольевич показывает, как паста телец включения с белком инсулина передается на очистку. Первая ее стадия — ренатурация и концентрирование.

Когда клетка синтезирует чужеродный белок, он представляет собой третичную структуру, свернутую неправильными связями. Поэтому необходимо растворить пасту телец включения в одном маленьком реакторе в воде, затем передать в одну из ренатурационных бочек, куда добавляют ферменты, которые разрезают этот белок, разворачивают его, затем другие ферменты сшивают его как надо. В результате получается правильно свернутый белок.

Далее полупродукт фильтруется и проходит несколько стадий очистки. На первой из них избавляются от крупных посторонних веществ, например липополисахаридов, по принципу разности зарядов. На следующей стадии отделяются близкородственные примеси и получается инсулин с 99-процентной чистотой. На стадии растворения и кристаллизации, часть примесей также извлекается. Далее фильтруют, сушат и получают кристаллический порошок. Он хранится в морозильных камерах при температуре -20 °С. В таком виде он передается на завод в Оболенске, где его растворяют и заполняют по флаконам, картриджам и шприц-ручкам.